Gavin X's List: 生命科学

• 1.信号通路是个大网，堵住一个未必有用
  2.信号通路调变迅速，EGFR抑制后的15分钟内，EGFR表达量会提高1000倍，EGF表达量（转录水平）会提高100倍，两天之内到达1000倍。FGFR等其它受体也会提高很多倍。通过上调同一信号通路的因子和受体，以及其他通路的受体和因子，细胞会自我调适。
  3.信号通路从来就是公用工具，肿瘤会有，不错，心脏也有，肝脏也有，任何器官都会有，都是公用的。都抑制住了，除非把人搞死，才能真正抑制住所有的信号通路
  4.抑制剂是非特异的。从来就没有特异的抑制剂。
  5.肿瘤的信号通路激活绝大多数是通过旁分泌实现的，局部浓度很高但是全身浓度并不增高或者增高很少，而我们给药要全身给，血循环浓度要大大高于肿瘤局部浓度，身体其他器官接受的药物浓度并不比肿瘤细胞更低。

• 先看综述，后看论著看综述搞清概念，看论著掌握方法。
• 多数文章看摘要，少数文章看全文
• 真正有用的全文并不多，过分追求全文是浪费，不可走极端。当然只看摘要也是不对的。
• 看文献的时间越分散，浪费时间越多。集中时间看更容易联系起来，形成整体印象。
• 做好记录和标记
• 这是避免时间浪费的又一重要手段。否则等于没看。
• 准备引用的文章要亲自看过。转引造成的以讹传讹不胜枚举。
• 刊物的影响因子、文章的被引次数能反映文章的参考价值。但要注意引用这篇文章的其它文章是如何评价这篇文章的：支持还是反对，补充还是纠错。
  
• 交流是最好的老师
• 对有身份的人，私下的请教体现你对他的尊重；对同年资的人，公开的讨论可以使大家畅所欲言，而且出言谨慎。千万不能闭门造车。
• 再好的工作最终都要靠别人认可。
• 表达能力，体现为写和说的能力，是需要长期培养的素质。
• 阅读10 篇文献，总结100 个常用句型和常用短语。经常复习。
• 找3-5 篇技术路线和统计方法与你的课题接近的文章，精读。写出论文的草稿。
• 某种具体方法、要讨论的某一具体方面，各找5-8 篇文献阅读，充实完善。
• 文献要追踪。开题时通过查文献了解的情况，到结题的时候可能有很大不同。
• 前面的实验记录要经常复习。随着经验的增加和认识的提高，你会发现最初的判断未必正确。
• 及时总结阶段性的工作，多写文章多投稿。
• 一定要舍弃那些与主旨关系不大的数据。否则，要么显得累赘松散，要么成为破绽。
• 目标：漫无目的则毫无效率，抓不住重点才效率低下。
• 对于一个具体的课题来说，相关文献分属于三个层次：研究方向、研究领域、研究课题。
• 研究方向层次的文献：一般涉及，基础知识，学科水准，了解当前重大进展与趋势，达到专业人员水平；研究领域层次的文献：了解焦点与热点，已/正/将进行的课题，达到专家水平；研究课题层次的文献：要全面，了解历史、现状、展望、主要方法、手段，达到No1专家水平。正确分辨文章的层次，才能把精力用到点子上。
• 教科书、专著、会议摘要汇编、期刊、网页、甚至ppt文件。比如要了解免疫应答的基本形式，最好是看教科书；要参考大鼠脑立体定位图谱，最好是看专著；要知道最新进展，最好是查阅期刊；要了解别人的研究动向，最好是参会或看会议论文汇编。不要找错信息源。
• 新手学习式阅读，逐字逐句，搞清细节，掌握最基本的知识点。最初的十几、几十篇要精读，精华的几篇甚至要背诵。
• 老手搜索式阅读，已熟悉各种研究的常见模式和一般套路，能够迅速提取关键信息，把握思路，经常不按常规顺序阅读。有人看图说话，有人辨数识字。高手批判式阅读，一针见血，直指问题所在。实际上没有一篇论文是无懈可击的。
• 看文献也要重视实验证据的强度。发现矛盾，是第一步；找出异同，是第二步；思考解决，是第三步。从相互矛盾的结论推导中发现矛盾的根源，此时如能跳出圈外，不走思维定势，从原始的科学问题出发，"无招胜有招"，真正是到达另外一种境界了。

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• 常用药物剂型有水溶液，油溶液，乳剂以及混悬液。
  其中水溶液最为常用，常将药物溶于生理盐水或蒸馏水；难溶于水的药物常用植物油制成油溶液供灌胃或肌注用；溶于油而不溶于水的药物出制成油溶液外，还可加入少量乳化剂制成乳剂使用；在水和油中都不易溶解的药物，可加入助悬剂制成混悬液，常用的助悬剂有1-2%西黄芪胶浆剂，1-2%羧甲基纤维素钠，35%阿拉伯胶浆剂和5%煮沸淀粉（需新鲜配置）。

• 根据生物药剂分类系统(Biopharmaceutics Classification System)的定义,如果你的药物属于第二类药物,也就是高透过性(high permeability)低水溶性,那么采取提高水溶性的方法,很可能有助于提高生物利用度.
• 即使属于第二类药物,提高水溶性的方法也不一定能提高生物利用度,另外一个重要的因素就是主药在吸收过程中的稳定性,包括肠道内的稳定性和在透过细胞过程的稳定性.如果药物在吸收之前降解很严重的话,很难保证理想的生物利用度.
• 如果药物属于第四类,低透过性(high permeability)低水溶性,那么一般说来即使采用提高水溶性的方法往往也得不到好的生物利用度结果.因为在这中情况下,药物吸收的限制性因素已经不只是溶解度了.  
• 生物利用度不高的原因一般是由以下几方面造成的。
  1.制剂不崩解不释放或释放不完全。
  2.在体内可够吸收的量不够。造成原因如药物在体内降解（蛋白多肽类），溶解度不高等。
  3.即使药物释放完全，在胃肠道也不会被破坏，但由于首过，生物利用度仍然不高。
  
• 1.2.两点可通过制剂手段提高崩解速率，提高溶解度，避免降解，以达到提高生物利用度的目的。如增加崩解剂提高崩解；楼主制备的的PVP固体分散体提高通解度，通过肠溶包衣避免胃中的降解。
  对于第3点，通过制剂手段是不能达到的，只有改变剂型避免首过效应而达到提高生物利用度的目的。如制备成舌下片，栓剂，注射剂等改变给药途径。  
• FDA有具体的规定,wys00朋友已经给你提供了分类的条件.
  具体的规定如下,
  1.在pH 1到7.5的范围内,药物的最大应用剂量应该可以溶解在小于等于250ml的水中,这样的药物可以称为高水溶性.
  2.给药后,药物吸收达到90%以上的,可以称为高透过性药物,90%是根据质量平衡实验,或者与静脉注射计量相比较,其实就是绝对生物利用度了.
  
  FDA还提供了那些实验可以用来测定药物的溶解度和透过性,如果有兴趣可以参考下面的网址.
  http://www.fda.gov/cder/OPS/BCS_guidance.htm  
• 还可以考虑助溶剂和增溶剂的方法，比如采用复合溶剂水-乙醇-甘油（80：8：2）、乙醇-甘油（4：6）或乙醇-丙二醇（4：6），具体的比例要视不同的药物来定。  

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• 专利检索欠缺 导致中药新药研发90%重复
• “即使在科技部973计划、863计划和国家重大专项研究中，也不乏重复研究问题。”刘延淮指出。
• 避免重复研究的最好方法，就是进行事前的专利分析和专利检索。一般来说，目前各国专利局及国际专利组织通过因特网向社会提供以公开专利数据库产品为依托的低端公益性信息服务，我国的国家知识产权局也可以进行类似的服务。免费专利信息数据库系统一般都提供未经加工的原始专利信息，检索功能相对简单，但可以满足普通社会公众的简单检索需求。
• 另据统计，全世界发明成果的70％~90％仅仅出现在专利文献中，而不会出现在杂志、论文、会议报告等媒体上。同一发明成果出现在专利文献中的时间比出现在其他媒体上的时间平均早1~2年。而对于专业化的检索需求，例如，涉及特殊专业信息的主题检索、化学结构检索、基因序列检索、公司代码检索、精确的专利战略分析等，仍然需要专业化的检索系统支持。
• 目前，世界上最著名的国际联机检索系统包括：汤姆森集团的DIALOG国际联机检索系统、美德日联合建立的STN国际联机检索系统和法国的Questel-Obit国际联机检索系统等。这些联机检索系统中，有许多专利数据库是经过深度加工标引的，具有强大的检索功能，例如：化学结构图形检索功能、基因序列相似性检索功能等。他们所收录的专利信息在规范完整性及检索功能方面都远远超过免费专利数据库系统，而且，所提供的信息的权威性不容置疑。
• 据刘延淮回忆，2000年，他们受原国家药品监督管理局委托，检索43种药物是否在中国申请了专利。国家知识产权局在中国专利文摘数据库中只检索出其中13种药物、43篇中国专利；为保证检索结果的可靠性，他们又用同等英文检索式在美国化学文摘数据库(CAPLUS)中进行国际联机检索(联机检索费2000多美元)，将检索结果限制成“中国专利”，查出36种药物、441篇中国专利。与在CAPLUS数据库中的检索结果相比，中国专利文摘数据库检索药物信息的漏检率在90％以上。
• 如果客户要检索的药物没有确切名称，只有化学结构式，就完全无法在中国专利文摘数据库中检索了。长期以来，国家知识产权局为国内许多客户检索中国专利中的药物信息，都不得不花费昂贵的外汇用国际联机检索系统在外国数据库中检索，否则，无法保证查全率和查准率。
• 但动辄每小时数百美元的使用费，几十美元一个检索结果的显示费，使我国研发机构陷入不查询会重复研究，查询又在科研经费原本不足的情况下还要花费高昂代价的境地。

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• 新药研发必看数据库
• 1 急性毒性数据库  http://www.cerc.usgs.gov/data/acute/acute.html
• 2 化合物毒性相关数据库 Toxnet http://toxnet.nlm.nih.gov/
• 3 SpectraOnline,Galact  http://spectra.galactic.com/SpectraOnline/ Default_ie.htm
• 4 临床药物试验研究信息 http://clinicaltrials.gov/
• 5 化学数据库
   NIST的Chemistry WebBook http://webbook.nist.gov/chemistry/
• 6 有机合成手册数据库（OS） http://www.orgsyn.org/
• 7 化合物基本物性库 http://chemfinder.camsoft.com
• 8 溶剂数据库SOLV-DB http://solvdb.ncms.org/solvdb.htm
• 9 三维结构数据库NCI-3D http://chem.sis.nlm.nih.gov/nci3d/  
• 10 化合物信息资源库 http://www.chemacx.com/
• 
   11 有机合成文献综述数据库 http://www.thieme-chemistry.com/ ... als/info/index.html  
• 12 预测LogP和LogW http://www.logp.com/
• 
   13 Chemical Information http://chem2.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/chemidlite.jsp
• 14 FDA  (www.fda.gov)
  
• 16 国家科技图书文献中心 http://www.nstl.gov.cn/index.html
• 15 SFDA （www.sda.gov.cn）
• 17 中国医药信息网数据库        http://www.cpi.gov.cn

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• 自噬和细胞死亡：趋向统一$ M, B9 y( B0 m: h/ l
   
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   , Y( i' P' I+ e: @1 h3 O6 m5 K$ v( f8 W& C5 I2 [7 [/ u
   Cell 131, 1032 – 1034, December 14, 2007" l6 z3 @. V' k" u' g
• 在应力条件下，如饥饿、低氧、热和药物处理，可诱导自噬。自噬的形态学特点是存在自噬体--有双层膜并含有待降解细胞质物质的细胞质囊泡。溶酶体通透酶释放的降解物质再回到细胞浆以便循环。自噬的这种能力可使细胞在饥饿条件下存活几天或几星期。
• 与之相矛盾的是，自噬也被认为参与称为自噬细胞死亡的一种编程式细胞死亡(II型PCD)，不同于凋亡(I型PCD)。
• 20多个自噬基因(atg)
• 揭示了在发育过程的生理条件下发生自噬细胞死亡，这种死亡是由类似于在细胞存活中起作用的自噬机制所控制。5 S( e% a4 [+ B5 i# V% b
• 自噬的主要调节因子包括I型磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)。
• PI3K通过胰岛素等生长因子传感是否存在营养物，它也受Ras家族的调节。活化的PI3K通过Akt激酶向抑制自噬并促进细胞生长的TOR（雷帕霉素靶标）激酶传递信号。
• 类固醇激素蜕化素引发幼虫唾液腺的PCD，这个过程发生的非常迅速。这些唾液腺的死亡显示出自噬细胞死亡的形态学。然而，蜕化素也能诱导唾液腺中的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)的活化，这是凋亡的特点。Caspase是否在自噬细胞死亡中起作用尚不清楚。因此，果蝇幼虫唾液腺是在生理条件下测试生长、自噬(atg基因)和Caspase在自噬细胞死亡中的作用的一个上佳模型。) p  O. L! W! K  v/ u: X7 a
• 为了在唾液腺中建立生长停滞和PCD之间的因果关系，他们在唾液腺中表达p110(PI3K的活性单位)、Akt和有活性的Ras(RasV12)，以便抑制生长停滞。在这些条件下，在成蛹后24小时唾液腺持续生长，唾液腺组织仍然存在。
• 阻止凋亡的细胞周期调节因子（如Myc或CyclinD/Cdk4）的表达，不能阻止唾液腺PCD。
• 尽管表达p110、Akt和RasV12 的唾液腺寿命有所延长，但这些唾液腺含有作为凋亡特征的活化的Caspase，并有DNA裂解。因此，尽管保持生长条件可阻断自噬细胞死亡，但是自噬细胞死亡的凋亡组分仍是完整的。
• 在Caspase突变体中或在表达Caspase抑制剂p35的唾液腺中，唾液腺即使不全部降解，也至少有部分降解，这说明Caspase不是唾液腺PCD所必需的。
• PI3Kp110活性亚基和Caspase抑制剂p35的共同表达，比只表达其中一个能使唾液腺更持久。因此，生长停滞和Caspase都在唾液腺的自噬细胞死亡中起作用。
• 不依赖Caspase的因子很可能是atg基因，它们是饥饿诱导的自噬所必需的
• Berry和Baehrecke发现7个不同atg基因的突变体或RNA干扰，可导致在蛹化后24小时唾液腺的降解不甚完全，这是自噬细胞死亡需要自噬和atg基因的第一个体内证据。这些数据也说明自噬细胞死亡不是由于将死亡的细胞无法尝试再生，如果是这种情况，唾液腺会在atg突变体中死亡。Atg1的超量表达诱导唾液腺分解提前启动
• 缺少atg的唾液腺也会有活性Caspase，对自噬和Caspase的共同抑制比只抑制其中一个因子能产生更多完整唾液腺。自噬和Caspase都在唾液腺的自噬细胞死亡中起作用。
• 这项研究证实生长停滞、自噬和Caspase都在生理条件下发生的自噬细胞死亡中起作用。
• 自噬是如何在生或死之间作决定？最可能的决定因子是Caspase。
• 在其他自噬细胞死亡模型（乳腺腔、胚胎凹和两栖发育）中也观察到Caspase的活性。在自噬中的Caspase活性可能是从存活到死亡的决定性因素。
• 尽管唾液腺含有活化的Caspase，但为什么仍通过自噬过程死亡？Caspase并不总是诱导凋亡，它在凋亡之外还有其他重要功能。参与自噬细胞死亡可能是Caspase的另一种非凋亡功能。但尚不清楚Caspase 怎样启动非凋亡响应。
• 现在很清楚在某些情况中自噬参与细胞死亡，在另一些情况中自噬促进细胞存活。尽管这是两种状况，但是如果把自噬看作是单纯为许多细胞和生物学过程提供能量和资源的分解代谢过程，可较好地解决由此产生的混淆。在某些情况中，这个过程可促进细胞存活，在另一些情况中，帮助细胞死亡。自噬的这种使不同情况相互关联的行为可能与人类健康有关。自噬有时阻止癌症，有时促进癌症。因为药物治疗会引起自噬，测定哪些类型癌症通过自噬达到存活，哪些癌症会有自噬细胞死亡是很重要的。Berry和Baehrecke的研究说明对自噬根据具体情况进行具体分析是很重要的。* Z" e, G% d5 _2 {9 W* N$ d6 b

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• 24孔板小室一般200µl。
• 4孔板下室一般加入500µl含FBS或趋化因子的培养基
• 下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
• 我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72h的IC50。用这个浓度处理细胞，24h内对细胞增殖并无明显抑制，但24h后，抑制作用就开始出现了。所以，用这个浓度来做Transwell，处理时间也必须限定在24h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。
• 时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达，到最后释放到培养基中，还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。

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• （4）肿瘤细胞侵袭实验

   

  常用8.0、12.0µm膜，原理与肿瘤细胞迁移实验类似。
• 
• 上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，但与肿瘤细胞迁移实验不同的是，聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。

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• 外部途径的活化是通过特定的死亡配体（如Fas配体、TNFα和TRAIL）与细胞表面的死亡受体（肿瘤坏死因子超家族成员）的相互作用而介导的。
• 死亡配体与受体的结合导致神经酰胺的产生。神经酰胺的释放被认为促进了脂筏的融合，让死亡受体大规模聚集。这种聚集放大了凋亡信号。
• 配体结合之后，受体的胞内结构域发生了构象变化，暴露出“死亡结构域”，并招募不同的凋亡蛋白。这个形成的蛋白复合物被称为DISC（诱导死亡信号复合物）。最后一个步骤是招募到一种caspase，通常是caspase-8前体，导致caspase-8的激活和凋亡的起始。
• TNFα与受体TNFR-1的结合导致受体的三聚化以及胞内死亡结构域的聚集。TNFR-1变构后，招募到一种胞内的接头蛋白TRADD（TNFR-associated death domain）。TRADD随后招募到多种不同的蛋白，如下游的TRAF2（TNF-associated factor 2），并激活NF-kB和JNK通路。TRADD也能与FADD（Fas-associated death domain protein）结合，并通过蛋白间相互作用招募到caspase-8前体，形成DISC。
• caspase-8前体自动裂解成有活性的caspase-8，并释放到细胞质中，起始下游的级联反应。

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• 某些蛋白，如caspase，表达的时间很短暂。正在经历凋亡的体外培养细胞，最终也必然会经历坏死。而且凋亡细胞会很快地死亡并消失。凋亡从开始到结束一共才2-3小时。因此，如果分析得太早或太晚，就难免出现假阴性。此外，凋亡可能以很低的频率出现，或只是出现在器官、组织中的特定位点。
• 毒素暴露的时间、待测化合物的浓度以及分析终点的选择就变得很重要。
• 任何活细胞/死细胞分析试剂盒，如台盼蓝或碘化丙啶（PI）都能挑出已经凋亡及坏死的细胞。不过，那些正在经历凋亡的细胞还能阻止这些染料进入，因此不会被挑选出。
• 细胞膜的重排发生在凋亡的早期。在许多凋亡细胞中，这种重排导致磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。这一事件可通过Annexin V的染色来检测。
• 这种方法的特点是灵敏，能检测单个凋亡细胞。但是坏死细胞的膜也会被标记上。因此，对于PS阳性的细胞，一定要验证膜的完整性。很多公司都提供了双重染色的试剂盒，来同时评估膜的完整性和PS外翻。
• 已知有些细胞类型在细胞表面组成型表达PS，因此Annexin V染色有可能导致假阳性的结果。
• DNA片断化是凋亡晚期的一个重要特征。
• 凋亡细胞就会产生阶梯状的电泳条带，间隔大约是180 bp。这种方法简单易行，灵敏度约为1×10⁶个细胞，对于凋亡细胞数量多的实验来说很有用。但换句话说，如果凋亡细胞的数量少，就不推荐使用了。
• 并非所有发生凋亡的细胞（如神经细胞、肝细胞、胚胎成纤维细胞）都会检测到DNA ladder。
• DNA片断化发生在凋亡的晚期，如果你没有检测到DNA片断化，那也不排除细胞正处于凋亡的早期。
• 更为常用的DNA片断化检测方法是TUNEL法。
• 可能会存在坏死细胞或其它细胞的假阳性。
• 无论是内部途径，还是外部途径，最终都汇集caspase上，因此caspase成为凋亡检测的大热门。
• 可以通过荧光标记的底物来检测有活性的caspase
• 可以通过免疫组化分析来检测切割的底物如PARP
• 有些方法需要裂解细胞，释放出caspase，这样就不能在组织中定位凋亡事件。
• 另一个缺点是caspase的激活并不是一定表明凋亡的发生。而且，caspase家族成员在底物偏爱性上有着很大的重叠，影响了分析的特异性。
• 想要评估待测样品与对照之间基因表达的差异，就可以考虑芯片。
• 通过芯片能绘制出编码配体、受体、细胞内调节器及转录因子的基因表达图谱。参与了抗凋亡的基因也能用这种方法评估。
• 线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。
• 通过阳离子染料在线粒体的聚集来检测线粒体膜电位。常用的染料有JC-1。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，产生绿色荧光。
• 常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。但是，这些染料并不能说明细胞凋亡的机制，应与其他凋亡检测方法如caspase分析共同使用。
• 在活细胞和固定细胞中，从线粒体中释放的细胞色素c能利用荧光和电子显微镜来分析。不过，细胞色素c一旦释放到细胞质中，就变得不稳定。因此，我们必须使用非凋亡的对照，来确保染色条件能够检测任何细胞色素c。

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• 细胞死亡的方式，目前认为可分为两大类型：细胞坏死（necrosis）和程序性细胞死亡（Programmed cell death，PCD）。对于程序性细胞死亡而言，一般又分为两类：凋亡（apoptosis）和自噬（autophagy）。
• 细胞死亡的方式，目前认为可分为两大类型：细胞坏死（necrosis）和程序性细胞死亡（Programmed cell death，PCD）
• 细胞死亡的方式，目前认为可分为两大类型：细胞坏死（necrosis）和程序性细胞死亡（Programmed cell death，PCD）。对于程序性细胞死亡而言，一般又分为两类：凋亡（apoptosis）和自噬（autophagy）。
• 细胞死亡的方式，目前认为可分为两大类型：细胞坏死（necrosis）和程序性细胞死亡（Programmed cell death，PCD）。对于程序性细胞死亡而言，一般又分为两类：凋亡（apoptosis）和自噬（autophagy）。
• 细胞死亡的方式，目前认为可分为两大类型：细胞坏死（necrosis）和程序性细胞死亡（Programmed cell death，PCD）。对于程序性细胞死亡而言，一般又分为两类：凋亡（apoptosis）和自噬（autophagy）。
• 在细胞凋亡早期，细胞膨胀变圆，与邻近细胞的联系断绝并且脱离后皱缩。在细胞质中，内质网肿胀积液形成液泡。在细胞核内，染色质逐渐凝集成新月状，附在核膜周边，嗜碱性增强。最终细胞核裂解为由核膜包裹的碎片。在细胞膜上，细胞结点不再相连，细胞膜变得更活跃进而发生内陷。这些变化都将导致细胞裂解为由细胞膜包裹细胞内容物的凋亡小体。在生理条件下，细胞膜上发生特定的调节作用，可以使吞噬细胞识别并吞噬凋亡小体，但不产生炎症反应。
• 自噬则是利用溶酶体对细胞自身体内的部分细胞质和细胞器进行一系列降解的过程。它的显著特征是形成大量自体吞噬小泡，内质网弥散和染色体发生中度凝集。自噬过程中的细胞骨架虽然解聚，但并不像凋亡过程那样发生明显的细胞骨架降解。
• 细胞坏死将导致细胞器如线粒体肿胀，细胞膜破损，大量细胞内容物渗漏，并伴随着周围组织的炎症反应。在一些情况下，细胞凋亡与细胞坏死能被很好地区分开来，但在某些情况下，即使是福尔摩斯，也难以判定细胞究竟是自杀还是他杀，因为濒死的细胞同时具备凋亡和坏死的特征。
• 当细胞调节的免疫反应减少，效应细胞就必须被清除，以防止它们攻击自身。凋亡机制的缺陷就会带来自身免疫疾病，如红斑狼疮和风湿性关节炎。
• 目前普遍认为有两条主要的凋亡诱导途径：死亡受体介导的凋亡途径或外部途径，线粒体凋亡途径或内部途径。虽然两条凋亡通路的上游事件不同，但是它们最终大都导致caspase的激活。

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• 常见蛋白质数据库
• 常见双向电泳数据库
• 常用蛋白质组分析网站与工具

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• 蛋白质组学研究中常用的网站和数据库
• 参考文献：
    Nucleic Acids Research, 2009, Vol. 37, Database issue
    Nucleic Acids Research, 2008, Vol. 36, Database issue   
   
   Ps：
   《Nucleic Acids Research》每年第一期是分子生物学数据库专刊，综述当前的分子生物学在线数据库。
    期刊主页：http://nar.oxfordjournals.org/

• 麻风树是一种理想的生物燃料作物，因为它可以生长在贫瘠的地方，不会对食物供应造成影响。由于产量不稳定，包括英国石油公司在内的公司已经撤回了投资，但是服部诚认为是计划出了偏差，造成印尼和缅甸的农民遭受了损失。
• “过去麻风树遇到的失败主要是因为对下游的物流和市场运作出了问题，”服部诚说道。“为了盈利，我们需要大幅提高它的产量。”
• 为了从麻风树业务中获利，石油价格和麻风树产量都必须提升，或是各国开始启动使用生物能源方面的立法进程。

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• 一般文献报道的方法，是贴壁细胞在细胞贴壁后加药物（一般为上板后24h），而悬浮细胞是上板同时加。
• 如果你要做有关细胞增殖的药物，加药的时机影响不大，主要是药物的作用时间起决定性因素。
• 如果你想做药物对细胞黏附功能的影响，可能就要在细胞贴壁 以前就要加药了。

• 贴壁细胞一般在试验前1-2日接入９６孔板，

   

  太晚，细胞在传代后有一个１６小时左右的停滞期，此时代谢变慢，增殖缓慢，及对数曲线的底部，此时的MTT数值太低了，

   

  太早了，实验时候，细胞生长过头，此时有死亡和凋亡的细胞，实验时本底又过高，让试验时落在对数早中期最好。
• 必须有适宜的效靶比，因为MTT是线粒体酶底物，效应细胞及靶细胞均能掺入，如果效应细胞数量太大，MTT掺入量太高，则不能有效地反映靶细胞的杀伤状态。
• 个人认为MTT中最重要的是背景对照，就是不加细胞的对照。这包括两方面内容，一是指与实验孔相同，对照孔中也加入相同体积的培养基，各做3-4复孔，取平均值，主要目的是为了减少培养基含有的酚红对比色的影响；二是要在对照孔内加入与实验孔相同成分和浓度的药物（特别是药物PH值为酸性或碱性时），同样也是为了减少比色时的误差。

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• 在MTT检测时实际上要求细胞大概能长满96-孔板的80-90%，如果打算养48小时就检测，根据细胞的生长情况反推点板时的细胞浓度状况
• 不要过分信赖细胞计数，因为细胞计数的取样量为20 微升左右，由于颗粒的分布不均匀，代表性是很差的
• 点板时一定要将细胞消化成单个细胞，而且一定要混匀，最好用排枪，否则，MTT的SD会狂大。
• 96-孔板的四周边孔，这32个边孔不能使用，建议加入灭菌PBS以饱和中间64个孔的水分
• 边孔的水分蒸发很快，培养液及里面的药物会出现浓缩现象，细胞的状况就复杂了，有些人称之为“边缘效应”这些孔的SD也会狂大，既然如此，不如不用。
• 如果确认你考察的药物没有氧化还原性，你可以直接加入MTT溶液（总体积的1/10）
• 如果你肯定考察的药物的氧化还原性很强，比如谷胱甘肽、Vit E、VitC，那建议你用PBS将细胞洗洗，否则这些药物会将MTT还原成棕褐色沉淀，这种效果可能是你不需要的。
• 时间为3-4h，此时弃去各孔中的液体在加入200微升的DMSO。为了将沉淀溶解完全，尽可能将水弃除干净，加入DMSO后在摇床上震摇10min
• 贴壁不好的细胞在点板时记得将96孔板用多聚赖氨酸处理处理，要么在弃液体时先用甩板机离心，再轻轻弃去液体
• DMSO的量，每孔的体积有点儿差异不干扰检测，只要能将沉淀完全溶解就行了
• 还原的MTT在460-630均有较好的吸收
• 可以在检测前扫描一下吸收谱，选用最大细说波长检测就是了，最大波长，大概在550nm附近，必要时加一个参比波长以扣除非特异性吸收。
• 在理想的MTT实验中，如果是细胞抑制实验，不加药物处理组的吸收值应该在0.8-1.2左右，太小检测误差占的比例较多，太大吸收值可能已经超出线性范围
• MTT应该新鲜配制，在4度保存最多不能超过2周，也有说10天的，反正不能太久
• 可以在700 nm做一个参比吸收，将每个孔的检测吸收减掉参比吸收后再分析
• 加入DMSO之前应尽可能将培养液弃除干净

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• 一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞
• 细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。
• 参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛
• 得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。
• 200ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。
• 调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜
• 高的血清物质会影响试验孔的光吸收值
• 每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
• 原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况
• 孵育16-48小时，倒置显微镜下观察
• 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h
• 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
• 过滤后4oC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融
• 配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。

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• Cell Counting Kit-8简称CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。
  
• WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan
• MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解；而WST-8和XTT、MTS产生的formazan都是水溶性的，可以 省去后续的溶解步骤
• WST-8产生的formazan比XTT和MTS产生的formazan更易溶解
• WST-8比XTT和MTS更稳定， 使实验结果更加稳定
• WST-8和MTT、XTT等相比，线性范围更宽，灵敏度更高。
• CCK-8的原理跟MTT其实是相同的，不同之处在于CCK-8法生成的formazan是水溶性的，不需要再吸出培养液加入有机溶剂溶解这个步骤，因此可以减少一定的误差。其他优点就是重复性优于MTT；对细胞毒性小；为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。

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• 脂溶性药物由被动扩散透过生物膜，由高浓度区到达低浓度区不需要消耗能量
• 胃肠液中浓度高，细胞浆液内浓度低，药物能被动扩散通过，又以同样机理转运到血液而吸收
• 单糖、氨基酸等，是借助于载体的帮助，能从浓度浓度处往浓度高处逆向转运
• 对主动吸收的药物可能存在某上最适剂量，超过此剂量不会有更高的治疗效应
• 一些非脂溶性物质或亲水性物质借助于细胞膜上载体物质的帮助，从高浓度向低浓度区扩散，也不需要消耗能量。扩散速度取决于膜两侧浓度差
• 膜孔转运的吸收速度，受药物分子或离子的大小、浓度以及水的吸收速度影响
• 多数药物的吸收属于“被动扩散”，故胃肠道上皮细胞对这些药物起着脂溶性屏障的作用，其中脂溶性药物通过被动扩散而吸收，非脂溶性药物的扩散通过屏障则相当困难
• 有胃中的pH环境下，弱酸性药很容易吸收
• 在胃肠中几乎不吸收而在肠内吸收的药物，其疗效的出现决定于药物离开胃进入十二指肠的速率
• 消化道上皮细胞膜具有脂质膜的特性，这样就对非离子性的有机弱酸和有机碱易吸收，离子型难吸收
• 非离子型与离子型的比例与环境pH直接相关
• 吸收速率又与油/水分配系数有关。一般是脂溶性愈强吸收愈好，这种关系称为pH—分配学说
• 药物以片剂、胶囊剂、颗粒剂或混悬剂口服，或用植入片或混悬剂肌注，其吸收过程为：固体药物→崩解→溶解→生物膜→吸收
• 化学结构相同的药物，可因结晶条件不同而得到不同的晶型这种现象称为多晶型。有机化合物的多晶型现象极为普遍
• 亚稳定型的熵值高、熔点低、溶解度大，故溶出速度也较快
• 可因晶型不同而呈不同的生物利用度，为较晶型，而稳定晶型药物往往低效甚至无效
• 由于胃肠液中的消化酶或pH的作用可导致某些药物的活性减低或失效
• 口腔粘膜分布着许多血管，在粘膜内层形成大血管网，口腔吸收后，药物通过颈内静脉到达心脏。随血液循环由全身分布，不存在胃肠道吸收后遇到的首过作用，口腔每天分泌1~2升唾液，其平均pH为6左右
• 口腔粘膜上皮细胞膜也由脂质体构成，故能充许脂溶性药物通过，其吸收属于被动扩散机制，与分配系数很有关系
• 片剂中的药物被唾液溶解后，通过口腔粘膜吸收，对于胃酸中灭活或首过作用大不宜口服的药物，应考虑从口腔吸收
• 有些药物或因在消化道分解，或因本质上难以吸收，只能采用注射给药；相反，也有不少药物不适于注射
• 无论肌肉注射或皮下注射，在注射部位附近都有充分的血液或淋巴液循环，从而可以预测吸收快，注射的药物一旦分布到结缔组织后，即向循环系统进行
• 除药物分子和生物膜的物理化学性质外，还有种种因素影响吸收的速度。如给药部位的选择，药物的浓度，热力学活性等对吸收速度均有重要关系
• 药物分子本身以及注射剂剂型本身的理化性质，常常影响药物的吸收
• 药物分子量越大吸收愈慢，分子量相当大的药物，通过毛细血管壁细孔或实质部分均有困难，只能以淋巴部位作为主要吸收途径，而淋巴循环要比血循环慢得多，淋巴流速只有血浆流速的万分之一
• 血流与吸收的关系是在血流量大时吸收速度基本固定，吸收的限速过程不是血流速度，而是药物的扩散。但当血流慢时，则血流速度变为主要因素
• 某些合成化学品，有毒气体和液体、化妆品和药物渗入皮肤时会产生局部或全身毒性
• 一般认为完整表皮具有类脂膜特性，肥许脂溶性药以不解离型式透入皮肤，解离型的较难透入
• 药物进入毛囊口就可能通过毛干或毛囊壁间隙或皮脂腺到在角质层以下的部位，再通过囊壁上皮细胞进入真皮或皮下组织。皮脂腺分泌物是油性的，也有利于脂溶性药物的透入
• 表面活性有助于药物等毛囊接触，对吸收有利
• 透皮吸收作为产生全身吸收作用的给药途径也是一个较新发展
• 角质层厚的部位不易透入，儿童皮较成人易吸收，粘膜吸收比皮肤要快得多
• 其速度依次下列次序增加：足底＜前下臂＜脚背、颅顶盖＜大腿上部及耳廓后部，在毛囊较大或较多的区域吸收较多，而在角质层较厚的地方吸收就减低
• 溶于类脂物的物质由于细胞膜含有类脂物故能被通过，而水溶性物质需在细胞壁蛋白质离子水合后才能通过
• 非常亲油的药物可聚积在角质层而不被吸收
• 离子型药物与分子型药物相比吸收较慢；分子量与吸收速率之间存在反比关系，即小分子渗透比大分子快，他子量在3000以上时不渗入，故以皮肤吸收适于分子量小的物质。

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