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Gavin X's List: 生命科学

有关MTT_细胞周期/增殖/凋亡检测_丁香通

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mtt 经验技巧 on 2009-12-11
- 一般文献报道的方法，是贴壁细胞在细胞贴壁后加药物（一般为上板后24h），而悬浮细胞是上板同时加。
- 如果你要做有关细胞增殖的药物，加药的时机影响不大，主要是药物的作用时间起决定性因素。
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- - 如果你想做药物对细胞黏附功能的影响，可能就要在细胞贴壁以前就要加药了。
  - 贴壁细胞一般在试验前1-2日接入９６孔板，
    
    太晚，细胞在传代后有一个１６小时左右的停滞期，此时代谢变慢，增殖缓慢，及对数曲线的底部，此时的MTT数值太低了，
    
    太早了，实验时候，细胞生长过头，此时有死亡和凋亡的细胞，实验时本底又过高，让试验时落在对数早中期最好。
  - 必须有适宜的效靶比，因为MTT是线粒体酶底物，效应细胞及靶细胞均能掺入，如果效应细胞数量太大，MTT掺入量太高，则不能有效地反映靶细胞的杀伤状态。
  - 个人认为MTT中最重要的是背景对照，就是不加细胞的对照。这包括两方面内容，一是指与实验孔相同，对照孔中也加入相同体积的培养基，各做3-4复孔，取平均值，主要目的是为了减少培养基含有的酚红对比色的影响；二是要在对照孔内加入与实验孔相同成分和浓度的药物（特别是药物PH值为酸性或碱性时），同样也是为了减少比色时的误差。
MTT实验心得_细胞周期/增殖/凋亡检测_丁香通

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mtt 实验方法技巧 on 2009-12-11
- 在MTT检测时实际上要求细胞大概能长满96-孔板的80-90%，如果打算养48小时就检测，根据细胞的生长情况反推点板时的细胞浓度状况
- 不要过分信赖细胞计数，因为细胞计数的取样量为20 微升左右，由于颗粒的分布不均匀，代表性是很差的
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- - 点板时一定要将细胞消化成单个细胞，而且一定要混匀，最好用排枪，否则，MTT的SD会狂大。
  - 96-孔板的四周边孔，这32个边孔不能使用，建议加入灭菌PBS以饱和中间64个孔的水分
  - 边孔的水分蒸发很快，培养液及里面的药物会出现浓缩现象，细胞的状况就复杂了，有些人称之为“边缘效应”这些孔的SD也会狂大，既然如此，不如不用。
  - 如果确认你考察的药物没有氧化还原性，你可以直接加入MTT溶液（总体积的1/10）
  - 如果你肯定考察的药物的氧化还原性很强，比如谷胱甘肽、Vit E、VitC，那建议你用PBS将细胞洗洗，否则这些药物会将MTT还原成棕褐色沉淀，这种效果可能是你不需要的。
  - 时间为3-4h，此时弃去各孔中的液体在加入200微升的DMSO。为了将沉淀溶解完全，尽可能将水弃除干净，加入DMSO后在摇床上震摇10min
  - 贴壁不好的细胞在点板时记得将96孔板用多聚赖氨酸处理处理，要么在弃液体时先用甩板机离心，再轻轻弃去液体
  - DMSO的量，每孔的体积有点儿差异不干扰检测，只要能将沉淀完全溶解就行了
  - 还原的MTT在460-630均有较好的吸收
  - 可以在检测前扫描一下吸收谱，选用最大细说波长检测就是了，最大波长，大概在550nm附近，必要时加一个参比波长以扣除非特异性吸收。
  - 在理想的MTT实验中，如果是细胞抑制实验，不加药物处理组的吸收值应该在0.8-1.2左右，太小检测误差占的比例较多，太大吸收值可能已经超出线性范围
  - MTT应该新鲜配制，在4度保存最多不能超过2周，也有说10天的，反正不能太久
  - 可以在700 nm做一个参比吸收，将每个孔的检测吸收减掉参比吸收后再分析
  - 加入DMSO之前应尽可能将培养液弃除干净
最全面的MTT相关技巧大汇总_1

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MTT 实验方法 on 2009-12-07
- 一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞
- 细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。
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- - 参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛
  - 得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。
  - 200ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。
  - 调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜
  - 高的血清物质会影响试验孔的光吸收值
  - 每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
  - 原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况
  - 孵育16-48小时，倒置显微镜下观察
  - 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h
  - 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
  - 过滤后4oC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融
  - 配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。
MTT法和CCK－8测定细胞毒性和增值的优劣比较 - 细胞毒理实验

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MTT CCK-8 细胞增殖实验方法 on 2009-12-07
- Cell Counting Kit-8简称CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。
- WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan
- 5 more annotations...
- - MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解；而WST-8和XTT、MTS产生的formazan都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤
  - WST-8产生的formazan比XTT和MTS产生的formazan更易溶解
  - WST-8比XTT和MTS更稳定，使实验结果更加稳定
  - WST-8和MTT、XTT等相比，线性范围更宽，灵敏度更高。
  - CCK-8的原理跟MTT其实是相同的，不同之处在于CCK-8法生成的formazan是水溶性的，不需要再吸出培养液加入有机溶剂溶解这个步骤，因此可以减少一定的误差。其他优点就是重复性优于MTT；对细胞毒性小；为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。
药物的吸收，临床药理

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药学药物吸收药代动力学 on 2009-12-04
- 脂溶性药物由被动扩散透过生物膜，由高浓度区到达低浓度区不需要消耗能量
- 胃肠液中浓度高，细胞浆液内浓度低，药物能被动扩散通过，又以同样机理转运到血液而吸收
- 34 more annotations...
- - 单糖、氨基酸等，是借助于载体的帮助，能从浓度浓度处往浓度高处逆向转运
  - 对主动吸收的药物可能存在某上最适剂量，超过此剂量不会有更高的治疗效应
  - 一些非脂溶性物质或亲水性物质借助于细胞膜上载体物质的帮助，从高浓度向低浓度区扩散，也不需要消耗能量。扩散速度取决于膜两侧浓度差
  - 膜孔转运的吸收速度，受药物分子或离子的大小、浓度以及水的吸收速度影响
  - 多数药物的吸收属于“被动扩散”，故胃肠道上皮细胞对这些药物起着脂溶性屏障的作用，其中脂溶性药物通过被动扩散而吸收，非脂溶性药物的扩散通过屏障则相当困难
  - 有胃中的pH环境下，弱酸性药很容易吸收
  - 在胃肠中几乎不吸收而在肠内吸收的药物，其疗效的出现决定于药物离开胃进入十二指肠的速率
  - 消化道上皮细胞膜具有脂质膜的特性，这样就对非离子性的有机弱酸和有机碱易吸收，离子型难吸收
  - 非离子型与离子型的比例与环境pH直接相关
  - 吸收速率又与油/水分配系数有关。一般是脂溶性愈强吸收愈好，这种关系称为pH—分配学说
  - 药物以片剂、胶囊剂、颗粒剂或混悬剂口服，或用植入片或混悬剂肌注，其吸收过程为：固体药物→崩解→溶解→生物膜→吸收
  - 化学结构相同的药物，可因结晶条件不同而得到不同的晶型这种现象称为多晶型。有机化合物的多晶型现象极为普遍
  - 亚稳定型的熵值高、熔点低、溶解度大，故溶出速度也较快
  - 可因晶型不同而呈不同的生物利用度，为较晶型，而稳定晶型药物往往低效甚至无效
  - 由于胃肠液中的消化酶或pH的作用可导致某些药物的活性减低或失效
  - 口腔粘膜分布着许多血管，在粘膜内层形成大血管网，口腔吸收后，药物通过颈内静脉到达心脏。随血液循环由全身分布，不存在胃肠道吸收后遇到的首过作用，口腔每天分泌1~2升唾液，其平均pH为6左右
  - 口腔粘膜上皮细胞膜也由脂质体构成，故能充许脂溶性药物通过，其吸收属于被动扩散机制，与分配系数很有关系
  - 片剂中的药物被唾液溶解后，通过口腔粘膜吸收，对于胃酸中灭活或首过作用大不宜口服的药物，应考虑从口腔吸收
  - 有些药物或因在消化道分解，或因本质上难以吸收，只能采用注射给药；相反，也有不少药物不适于注射
  - 无论肌肉注射或皮下注射，在注射部位附近都有充分的血液或淋巴液循环，从而可以预测吸收快，注射的药物一旦分布到结缔组织后，即向循环系统进行
  - 除药物分子和生物膜的物理化学性质外，还有种种因素影响吸收的速度。如给药部位的选择，药物的浓度，热力学活性等对吸收速度均有重要关系
  - 药物分子本身以及注射剂剂型本身的理化性质，常常影响药物的吸收
  - 药物分子量越大吸收愈慢，分子量相当大的药物，通过毛细血管壁细孔或实质部分均有困难，只能以淋巴部位作为主要吸收途径，而淋巴循环要比血循环慢得多，淋巴流速只有血浆流速的万分之一
  - 血流与吸收的关系是在血流量大时吸收速度基本固定，吸收的限速过程不是血流速度，而是药物的扩散。但当血流慢时，则血流速度变为主要因素
  - 某些合成化学品，有毒气体和液体、化妆品和药物渗入皮肤时会产生局部或全身毒性
  - 一般认为完整表皮具有类脂膜特性，肥许脂溶性药以不解离型式透入皮肤，解离型的较难透入
  - 药物进入毛囊口就可能通过毛干或毛囊壁间隙或皮脂腺到在角质层以下的部位，再通过囊壁上皮细胞进入真皮或皮下组织。皮脂腺分泌物是油性的，也有利于脂溶性药物的透入
  - 表面活性有助于药物等毛囊接触，对吸收有利
  - 透皮吸收作为产生全身吸收作用的给药途径也是一个较新发展
  - 角质层厚的部位不易透入，儿童皮较成人易吸收，粘膜吸收比皮肤要快得多
  - 其速度依次下列次序增加：足底＜前下臂＜脚背、颅顶盖＜大腿上部及耳廓后部，在毛囊较大或较多的区域吸收较多，而在角质层较厚的地方吸收就减低
  - 溶于类脂物的物质由于细胞膜含有类脂物故能被通过，而水溶性物质需在细胞壁蛋白质离子水合后才能通过
  - 非常亲油的药物可聚积在角质层而不被吸收
  - 离子型药物与分子型药物相比吸收较慢；分子量与吸收速率之间存在反比关系，即小分子渗透比大分子快，他子量在3000以上时不渗入，故以皮肤吸收适于分子量小的物质。
药物的吸收及影响因素

www.med66.com/...20091118zhangx113029.shtml - Preview

药物吸收药代动力学 on 2009-12-04
- 现将常见的影响药物吸收的因素及必要的注意事项简结如下，供患者参考：
- 胃是人体重要的消化器官，也是很多药物重要的吸收部位，药物口服后首先到达的就是胃，并在胃内停留一段时间，而后通过十二指肠进入小肠，单位时间内胃内容物向小肠排出的量就叫胃排空速率
- 11 more annotations...
- - 小肠是人体最大、最主要的吸收器官，药物的吸收也同样以小肠为主
  - 胃空速率增加时，多数药物吸收加速，对酸不稳定的药物或希望速效的药物比较有利，但对于主要靠胃粘膜吸收的药物（如某些弱酸性药物）反而减少其吸收，如维生素B2
  - 有些因素会影响胃排空速率，如：同服某些药物（654-2等延缓胃排空），体位（左侧卧排空速度快，右侧卧则慢），疾病状态（胃酸过高时排空速度慢）
  - 药物在肠内的滞留时间和运行速度对药物的吸收是至关重要的，药物滞留时间愈长、在肠内运行愈缓慢，吸收愈完全彻底
  - 胃肠道酸碱度、胃肠粘膜血流速度、肝脏的首关效应等对某些药物的吸收也会产生不同程度的影响
  - 药物的脂溶性大，药物的吸收好，但脂溶性过大时，药物和粘膜细胞膜结合过于牢固，也会影响药物进入血液循环
  - 其次药物的溶出速度，固体制剂必须在胃肠液中先溶解，然后才能被粘膜吸收，如果药物的在胃肠液中溶解的速度太慢（主要是一些难溶药物），也会影响药物的吸收
  - 药物在胃肠液中的稳定性对药物的吸收也有影响，如果药物在胃肠液中不稳定，就容易分解失活，使药物的吸收量减少
  - 用口服制剂吸收由快到慢的顺序是：口服液>散剂>颗粒剂>胶囊剂>片剂>包衣片
  - 空腹比进食后药物胃空速率快，食物吸收胃内水分，会延缓固体制剂的溶出，减慢药物的吸收
  - 高脂肪饮食能促进胆汁的分泌，增加血液及淋巴循环，同时胆酸可增加难溶药物的溶解度，利于吸收
细胞凋亡检测方法

61.153.27.163/...xbdljc.html - Preview

凋亡 on 2009-12-03
- 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。
- 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。
- 27 more annotations...
- - Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml
  - 细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。
  - 凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。
  - 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中
  - Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合
  - 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染
  - 整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞
  - 操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测
  - 线粒体跨膜电位的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转
  - 将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为Rhodamine 123（1mM）或终浓度为DiOC6（25nM），JC-1（1mM），TMRM（100nM），37°C平衡30min，流式细胞计检测细胞的荧光强度。
  - 始终保持平衡染液中pH值的一致性，因为pH值的变化将影响膜电位
  - 与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白，他们将与部分染料结合，降低染料的浓度，引起假去极化
  - 收获细胞（1X107）沉淀，细胞裂解液，13000rpm′5min, 收集上清，1%SDS和RnaseA（5mg/ml）56°C， 2h，蛋白酶K（2.5mg/ml）37°C，2h，1/10体积3M醋酸钠和2.5倍体积的冷无水乙醇沉淀DNA，4°C过夜，14000rpm′15min，最后将沉淀溶解在TE buffer中，加DNA Loading Buffer，1.2%琼脂糖凝胶电泳
  - 参考文献 Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-5507
  - caspase-3为关键的执行分子
  - Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。
  - 激发光波长380nm，发射光波长为430-460nm
常见固定剂的特点比较

sunahane.blog.163.com/...3093768200710244143166 - Preview

固定免疫组化免疫荧光 on 2009-12-01
- 乙醇，甲醇和丙酮属于凝结类固定剂，优势在于能够通过快速改变细胞成份的水合状态而固定标本，蛋白被凝结或者萃取，并常能保存抗原识别位点。缺点是导致标本的明显的皱缩，使细胞高度缩到原来的一半。
-                戊二醛                甲醛              冷甲醇/丙酮
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  适用固定组分   微细结构（微管定位）     较广            常检测细胞骨架
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  剧烈程度                      最剧烈              较稳和              作用快
  ---------------------------------------------------------------------------------------------------
  对抗原抗体影响          形成交联         不形成或可逆      可以造成抗原
                                可以阻止反应          影响小          定位分布的改变
  ---------------------------------------------------------------------------------------------------
  产生荧光               可产生自发荧光         不产生                     --------
  ---------------------------------------------------------------------------------------------------
  固定及渗透            固定强，渗透弱     固定较弱渗透强   固定同时造成透化
  ---------------------------------------------------------------------------------------------------
  使用浓度         0.01%~0.5%           2%~4%              50%
  作用时间           20m~1h            10m~30m            10m~30
- 7 more annotations...
- - 常用的交联类固定剂包括glutaraldehyde戊二醛Formaldehyde甲醛。戊二醛因为会导致组织自发荧光在荧光显微中较少应用，主要保持电镜下的亚细胞结构。
  - 对大多数组织而言，乙醇，甲醇和丙酮并不能很好的保持结构，组织会缩小或者变形
  - 对绝大多数抗体而言，4％的paraformaldehyde（多聚甲醛）是个好的初步选择，4oC半个小时到一个半小时不等。
  - 乙醇，甲醇和丙酮属于凝结类固定剂，优势在于能够通过快速改变细胞成份的水合状态而固定标本，蛋白被凝结或者萃取，并常能保存抗原识别位点。缺点是导致标本的明显的皱缩，使细胞高度缩到原来的一半。
  - 冷甲醇/丙酮因为和细胞的蛋白沉淀而不能更好地保持细胞的组织形态，不作为首先，常作为透化的选择。
  - 戊二醛的固定效果最强，甲醛（多聚甲醛）较温和，为荧光的首选，为了有良好的固定效果，可以两者合用
  - 市售的甲醛含有甲醇(6-15%，稳定剂）
不同染色法对流式细胞术中DNA含量检测的影响

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PI 流式凋亡 on 2009-12-01
- 在细胞发生凋亡时染色体基因组DNA的片段化，细胞膜通透性增加，小分子DNA片段丢失，荧光染色程度下降，在G1峰前呈现特征性亚二倍体峰(即凋亡峰)。
- 用70%冷乙醇固定，并悬浮成单细胞
- 4 more annotations...
- - 乙醇固定的肿瘤细胞，PBS清洗2次后，加入PI(50 μg/ml)-RNase A(50 μg/ml)-PBS(10 mmol/L,pH 7.2)直接染色，37℃温育30 min，上机检测。
  - 用低渗法得到的DNA直方图中，G1峰均比其他三种方法偏右，即荧光强度总体上偏强，这与低渗法的原理有关。低渗法是将细胞处于低渗条件下直接用PI染色，而不加RNase A去除RNA，荧光染料PI使DNA和RNA均染上了色，增大了每个细胞的相对荧光强度，从而造成了整个细胞周期的右移。
  - 样品经染色后，存放30 min至2 h(短时存放)或16 h以上(长时存放)的检测结果有所差异。一步法中，短时存放的样品细胞周期分布均匀，有明显的G1峰、G2峰，呈正常分布，而长时存放的样品则没有出现。
  - 染色后应尽快测量
流式细胞仪检测细胞凋亡——Heochst 33342/PI双染色法_细胞分析_丁香通_专业医药商业信息平台

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hoechst33342 凋亡流式 on 2009-12-01
- 活细胞染料如Hoechst 33342能少许进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高，Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度增高的机制与凋亡细胞膜通透性发生改变有关，凋亡细胞早期细胞膜的完整性没有明显性改变，但细胞膜的通透性已有增强，因此进入凋亡细胞中的Hoechst 33342比正常细胞的多
- 还与凋亡细胞的染色体DNA的结构发生了改变从而使该染料能更有效地与DNA结合以及凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将Hoechst 33342排出到细胞外使之在细胞内积累增加等有关
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- - 而EB、PI或7-AAD等染料是不能进入细胞膜完整的活细胞中，即正常细胞和凋亡细胞在不经固定的情况下对这些染料是拒染，坏死细胞由于膜完整性在早期即已破损，可被这些染料染色
  - 这三群细胞表现分别为：正常细胞为低蓝色/低红色（Hoechst 33342/PI ），凋亡细胞为高蓝色/低红色（Hoechst 33342/PI ），坏死细胞为低蓝色/高红色（Hoechst 33342/PI ）。
  - Heochst 33342 染液：用PBS配成10ug/ml的储存液浓度，4℃避光保存；
    　　PI染液：用PBS配成5ug/ml浓度，4℃避光保存。
  - 悬浮生长的细胞在培养的状态下加入Heochst 33342，终浓度为1ug/ml； 37℃孵育7～10min。
  - 低温500～1000r/min离心5min弃去染液
  - 加入1.0ml PI染液，4℃避光染色15min
  - 400目的筛网过滤1次
  - 流式细胞仪分析：Heochst 33342用氪激光激发的紫外线荧光，激发光波波长为352nm，发射光波波长为400～500nm，产生兰色荧光；PI用氩离子激光激发荧光，激发光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光。分析兰色荧光对红色荧光的散点图或地形图
  - 用Heochst 33342染料与细胞孵育的时间不宜过长，一般控制在20min之内为宜。如果太长可引起Heochst 33342的发射光谱由蓝光向红光的迁移，导致红色荧光与兰色荧光的比例改变
PI染色检测细胞周期protocol-丁香通-专业生物医药商业信息平台

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PI染色细胞周期凋亡流式 on 2009-12-01
- PI染色检测细胞周期protocol
- 离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次。
- 12 more annotations...
- - 加入预冷70%乙醇，于4℃固定过夜，或-20℃长期固定（4℃过夜一般隔天就进行检测，如果想推迟几天测，那就保存在-20℃
  - 有些实验是在不同时间点上收细胞，这时我就等最后一次固定完了一块测，基本上也多在一周内检测完毕
  - 离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入500uLPBS含50ug/mL溴化乙锭（PI），100ug/mL RNase A， 0.2% Triton X-100， 4℃避光孵育30分钟（PI我是直接用PBS配成工作浓度，然后加入细胞沉淀混匀，RNA酶现加，但有时不加发现对实验结果也没太大的影响）。
  - 一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。
  - 细胞周期流式后一般分为G0/G1,S,G2/M期三部份，如果有凋亡，在G0/G1期前面有个凋亡峰(也称sub-G0期),而如果分析时细胞窗口没设置好，可能在最前面还有细胞碎片峰。
  - G2/G1为2.0（即G2期为4倍体细胞，而G1期为2倍体细胞，比值为2）
  - 峰的变异系数为4.54%（好）
  - 细胞碎片为0.48%，细胞聚集体有0.06%。
  - 总的细胞数（仪器检测到的）为17525个，
  - 在细胞周期中分析的细胞数为17431个（即排除了碎片及聚集体后）
  - CV是变异系数。一般CV越小，峰形越好，越尖锐。能控制在5%左右是比较好的结果，一般小于10%就可以认可了。
细胞凋亡形态学检测与观察

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凋亡1形态 on 2009-12-01
- 细胞发生凋亡时，染色质会固缩。所以Hoechst染色时，细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。
- 8 more annotations...
- - 早期凋亡特异性的特征被annexin－5检测到。晚期凋亡和坏死细胞被pi染色。
  - 凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。
  - a microscope image of a group of normal cells and one apototic cell which binds annexin (green) on the surface
细胞凋亡形态学检测与观察(2)

ggene.cn/...2487_2.html - Preview

凋亡形态 on 2009-12-01
- In apoptosis condensation and fragmentation of chromatin occurs. Subsequently, nuclei loose their round or oval shape, bud and become fragmented - apoptotic bodies are formed
- Nuclei of normal human fibroblasts in culture, in early spontaneous apoptosis
- 10 more annotations...
- - Nuclei of normal human fibroblasts in culture， in advanced spontaneous apoptosis
  - Images of nuclei in early apoptosis.
  - Images of nuclei in mid apoptosis
  - Images of nuclei in late apoptosis
《默克家庭诊疗手册》_第6节　药物的给药途径、分布和排泻

www.zysj.com.cn/...1028-7-2.html - Preview

小分子药物代谢给药 on 2009-12-01
- 口服药物经胃肠道吸收。药物吸收始于口腔和胃，但大部分由小肠吸收。药物必须通过小肠壁及肝脏方能进入全身血循环。许多药物在肠壁和肝脏发生化学变化(代谢)，减少了吸收的药物量。静脉注射药物不经肠壁和肝脏直接进入体循环，这种给药方式可获得较口服更快和更持久的效应。
- 一些口服药物刺激胃肠道，如阿司匹林和大多数其他非类固醇抗炎药可损害胃和小肠壁并诱发溃疡。另一些药物吸收很差或在胃内被胃酸和消化酶破坏。尽管有这些缺点，口服给药较其他途径常用。其他给药途径一般在患者不能经口给药，药物必须尽快和准确地给予，或药物口服吸收很差且不规则时方才使用。
- 23 more annotations...
- - 皮下注射时，注射针头插入皮下，注射后，药物进入小血管随血流进入体循环。皮下注射常用于蛋白质类药物和胰岛素给药，该药口服可被胃肠道破坏。皮下注射的药物可制成混悬剂或相对难溶的混合物，这样吸收过程可保持数小时、几天甚至更长，患者亦不须经常给药。
  - 在给予容积更大的
    药物时常采用肌肉注射。肌注时应采用更长的针头，因肌肉位置深于皮肤。
  - 静脉注射时，针头直接插入静脉。在消化道外所有给药途径中，静注是最困难的一种，特别是肥胖病人静脉穿刺更加困难。无论是单剂静脉推注还是连续的静脉滴注均是快速、准确给药的最佳途径。
  - 一些药物可置于舌下(舌下给药)，能被舌下小血管吸收。舌下给药对硝酸甘油类药物特别好，这类药物可缓解心绞痛，它们可不经肠壁和肝的首过效应而迅速直接进入体循环。然而，多数药物不能使用此途径，因常常发生吸收不全及不规则现象。
  - 药物与蜡状物混合制成栓剂，即便插入直肠亦不会溶解。药物可通过直肠壁丰富的血循环迅速吸收。
  - 这类药物可增强皮肤渗透性，不经注射便可经皮进入血循环。这种经皮给药可缓慢持续很多小时或很多天，甚至更长。然而，这种途径受药物通过皮肤快慢的限制。只有那些日给药量少的药物可采用此途径
  - 这些药物通过气道直接入肺，并在肺内吸收入血循环。只有少数药物可用此途径
  - 因喷雾吸入进入血液的药量差异性大，故这种途径很少用于治疗除肺以外的其他组织或器官疾病
  - 如果片剂溶解和释放药物太快，就可能造成瞬时的药物浓度过高而诱发药物过量反应。在另一方面，如果片剂不溶解且释放药物不够迅速，多数药物可能随粪便排出体外而影响机体吸收。腹泻使药物快速通过胃肠道，吸收减少。因此，食物、其他药物及胃肠道病变都可影响药物的生物利用度。
  - 但由于厂家不同，虽然药物所含活性成分一样，可因含非活性成分的差异而影响药物的吸收。因此不同厂家生产的同一药物，即便使用同一剂量，也可能药效并不相同。
  - 有保护膜的阿司匹林可防止损伤胃粘膜或防止该药在胃酸中被分解。这种具被膜形式的药物到达低酸或低消化酶环境即小肠方可被溶解。并不是所有人都能溶解这种保护膜，许多人，特别是老人，可把这类药物完整地排入粪便。
  - 填充液体的胶囊剂吸收速度快于填充固体颗粒的胶囊剂
  - 药物吸收入血循环后，当血液平均循环时间为1分钟时，即可迅速分布于全身。但药物从血液转移到机体组织的过程较慢。
  - 药物渗入不同组织的速度不同，速度大小由它们穿透细胞膜的能力决定。
  - 一般而言，脂溶性药物比水溶性药物透过细胞膜的能力强，分布速度亦更快。
  - 多数药物并不能均匀分布全身，一些药物集中在含血液和肌肉较多的含水组织，而另一些集中在甲状腺、肝和肾。一些药物与血浆蛋白结合，以至于离开血液非常缓慢，而另一些药物则很快离开血循环进入其他组织，一些组织药物浓度很高，可作为该药贮存库，因而延长了药物的分布时间。事实上，一些药物，如可积聚于脂肪组织的药物，离开这些高浓度组织的速度很慢并于停药后数天仍出现在血循环里。
  - 身材高大之人比常人有更多的组织和血容量，应给予较大剂量的药物。肥胖者可贮存大量易积聚在脂肪组织中的药物，而很瘦的人仅能贮存相对少量的该类药物。这种分布现象也
    见于老年人，因随年龄增长，机体脂肪比例增加。
  - 药物的代谢过程是药物化学结构被机体改变的过程，肝脏是主要代谢器官，但并不是唯一的代谢场所。
  - 前体药物，以非活性形式
    存在，它们的代谢物具治疗活性并能获得所期望的疗效，这些活性代谢物可被排出体外(主要随尿、粪排出)，也可进一步转化成无活性代谢物且最终被排出体外。
  - 机体清除药物的过程称排泄。肾脏是主要清除器官，对水溶性药物及其代谢物的排泄特别有效。
  - 许多因素影响肾脏对药物的排泄能力，被排除的药物或代谢物必须溶于水且不能与血浆蛋白结合过牢。尿液酸度可影响一些酸性和碱性药物的排泄。肾脏对药物的排泄也依赖于尿流速度，肾脏血流以及肾脏的功能。
  - 如果肾功异常，医生必须调整主要由肾清除的药物的使用剂量。
  - 肝脏通过胆汁可排出一些药物，这些药物进入胃肠道，如果不被重吸收入血或被分解最终由粪便排出。此外，唾液、汗液、乳汁甚至呼出的气体亦能排出一些药物，在肝病患者应用主要由肝脏代谢的药物时需调整用药剂量。
Cleavage Efficiency Close to the Termini of PCR Fragments

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PCR 引物设计保护碱基 on 2009-12-01
- Cleavage Efficiency Close to the Termini of PCR Fragments
- to determine how many extra nucleotides should be added to the 5’-end of the PCR primer next to the introduced recognition site to ensure efficient cleavage
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- - Enzyme
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[转帖] 关于保护碱基[宝生物论坛]

www.takara.com.cn/...dispbbs.asp - Preview

PCR 引物设计保护碱基 on 2009-12-01
- PCR的引物导入的序列,或其它方式得到的序列, 如果该位点处于线性片段的末端,酶切的效率可能会受到影响而导致酶切不开或不完全, 所以通常要在识别序列前, 即线行片段的末端加入几个碱基,将位点保护起来,使得它不是处于"最边缘"; 序列内识别序列的另一端,本身不是什么末端,就别去管它了.
- 明白了上面说的内容,很容易知道,加什么碱基都是可以的.Biolabs的目录和网站里有个资料,是不同内切酶识别序列,两端加入不同数目的碱基并检测其切割效率的, 这个表, 成为很多人产生错误结论的"理论根据", 很多人以为,某个酶的保护碱基就应该加那几个碱基, 人家Biolabs可没这么说. 老实说,这个表参考意义没那么大,Oligo的切割,和长片段内部或长片段末端位点的切割行为是不一样的, 那个表也就是个参考而已.
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- - 实际工作中,比如设计引物5'端导入酶切位点的时候, 一般导入3~4个;导入的碱基, 最好是A/G/C/T比较平均,并能部分平衡整个引物的GC%和Tm;G/C为主,可以使引物5'形成所谓GC Clamp(有的软件,认为这样好). 别的就没什么了.
  - 最好不要直接酶切后装入表达载体. 因为表达载体的拷贝数及操作,通常不如常用的克隆载体容易.
  - 我做了，可以随便加，关键是数目！
酶切位点的设计

wanghong1983713.blog.sohu.com/25848498.html - Preview

PCR 引物设计 on 2009-12-01
- 酶切位点的设计
- 所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，往往导致两个酶都切不好
- 17 more annotations...
- - 能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切
  - promega的说明书上说，最好隔四个
  - 两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切
  - 最好使用双酶切有共同buffer的酶
  - 对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。计算Tm时，只计算互补的区域（除非你的酶切位点也与模板互补）。不少战友设计的引物都Tm过低，是因为他们误把保护碱基和酶切位点都计算到Tm里了，最后的结果是导致了PCR反应的诸多困难。
  - 设计引物的时候，先不管5'端的修饰序列，把互补区的Tm控制在55度以上（我喜欢控制在58以上，具体根据PCR的具体情况，对于困难的PCR，需要适当提高Tm）
  - Tm温度高的引物就比较容易克服3‘发卡、二聚体及3'非特异结合等问题
  - 如你设计了带酶切位点的引物，总长分别为29、33个碱基，去掉酶切位点和保护碱基，分别为17、21个碱基。引物公司给的单子是70多度，实际用的只有50度，用55度扩的结果也差不多
  - 引物公司给你发的单子是包括酶切位点的
  - 需要考虑的参数包括：base number、GC%、Tm、hairpin、dimer、false priming、cross dimer
  - 关于引物二聚体，最好用primer或是其他设计引物的软件进行计算一下，看看引物之间的△G（自由能）的绝对值，如果小于10，一般是问题的。如果稍大，PCR时可以提高一下退火温度，一般是没有问题的。如果3’端形成二聚体，并且自由能绝对值较大，如果PCR没有条带，建议重新设计引物。此外，所加的三个核苷酸的保护序列经过尽心设计有时也可以降低二聚体的△G。
  - 引物的3’端是引发延伸的起点，因此一定要与模板准确配对，应尽量避免在引物3’端的第一位碱基是A。（容易错配）引物3’端最佳碱基的选择是G和C，因为他们形成的碱基配对比较稳定。
  - 当计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。
  - 引物顺序应是：5’—保护碱基+酶切位点+引物配对区—3’
  - 只要在5‘端加保护碱基可以了。其实保护碱基就是要给限制性内切酶一个结合位点，3‘端还有更长的引物序列在，当然不需要再加保护碱基了
  - NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。（这里用的是寡核苷酸！！而不是末端带酶切位点的肽链！）
  - 我觉得这只能说明酶在作用于识别位点时所需占据的链长，并不能说明在设计酶切位点时要加那么长的保护碱基，比如我用的NotI，要加10个碱基，切25个小时才95％的效率，这还是用了20倍的酶量！我师姐只加了4个碱基，也没见出现问题。
请教如何计算引物的Tm值？

ask.bbioo.com/show-82.html - Preview

生物 PCR 引物设计 Tm值 on 2009-12-01
- In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.
- 引物设计软件都可以给出Tm，引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度有关。
  
  长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)
  
  对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：
  
  Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size
  
  公式中，Size = 引物长度。
抗肿瘤药物药效学评价中的关注问题

www.cde.org.cn/dzkw.do - Preview

肿瘤生物药效学小分子药物 on 2009-12-01
- 抗肿瘤药物药效学评价中的关注问题
- 其主要问题之一是部分临床试验的新药并没有给患者带来明显获益。我们可以接受有一定毒性的新药进入临床试验，但无明显疗效的新药在临床研究中会被最终淘汰。
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- - 本人根据自己对抗肿瘤新药药效学审评的体会，进一步总结了抗肿瘤新药药效学评价中需关注的几个问题，以供研发者参考。
  - 试验还应同时考察药物对正常人源细胞的影响，以考察药物对肿瘤细胞和正常细胞影响的差异
  - 药物与细胞共培养的时间一般为48~72 小时，贴壁细胞需先贴壁24 小时后再给药
  - 试验应设阳性及阴性对照组，阳性对照为标准抗肿瘤药，阴性对照为溶媒对照。试验至少应重复一次。
  - 动物肿瘤移植模型与临床疗效之间的相关性不强，仅可用于侯选化合物的初步筛选。但为了证明新药可能具有明显的抗肿瘤作用，建议在尽可能多的模型中评价其抑瘤作用。目前的评价标准是至少在3种以上模型中显示有明显的抗肿瘤活性。
  - 应在移植肿瘤生长至一定大小后开始给药，如达到100mm3以上
  - 受试药物一般包括高、中、低3个剂量的治疗组、阳性对照组和阴性对照组。治疗组受试物剂量的选择应能够体现出药物的量效关系，高剂量不宜超过受试物的最大耐受剂量
  - 应根据受试物的药动学特点和毒性反应等确定给药频率和周期；给药途径应尽量与推荐临床用药的途径相同
  - 强调选用合理的阳性对照药，用于验证模型的成功性，并比较新药与现有标准治疗药物的药效学差异。阴性对照组应给予相应的溶剂或辅料。
  - 肿瘤直径的测量次数根据移植瘤的生长情况而定，一般为每周2~3次
  - 还应该观测与药物安全性有关的指标，如动物体重增长和死亡率
  - 鼓励药效学研究中测定血液和肿瘤组织中的药物暴露量，以进行PD/PK分析和上临床前新药安全性范围的评估。
  - 新化合物在临床前药效学研究中单药使用不一定能够显示出优越的抑瘤作用，但若与其它化疗药物合用具有增效减毒特点，也会提示新药的开发潜力
  - 考虑在耐药株及其动物模型中进行药效学研究
  - 药效学研究中应加强对其作用机制的研究或确证，阐明靶点活性与抑瘤作用的关系，并比较新化合物与同类药物的作用强度，以从作用机制角度提示新药的药效学开发潜力
IF/ICC实验步骤

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固定细胞实验生物免疫组化免疫荧光 on 2009-12-01
- 除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。固定的目的有三：
  
  ①防止细胞从玻片上脱落；
  
  ②除去防碍抗原-抗体结合的类脂；
  
  ③使标本易于保存。
- 标本的固定原则是：
  
  ①不能损伤细胞内的抗原；
  
  ②不能凝集蛋白质；
  
  ③应保持细胞和亚细胞结构；
  
  ④固定后应保持通透性，以保证抗体自由进入所有细胞与亚细胞组分与抗原结合。
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- - 常用的固定剂有多种，应根据所研究抗原的性质和所使用的抗体特性选择适当的固定剂。通常固定方法可以分为两类：有机溶剂和交联剂。有机溶剂如甲醇和丙酮等可去除类脂并使细胞脱水，同时将细胞结构蛋白沉淀。交联剂如多聚甲醛通常通过自由氨基酸基团形成分子间桥连，从而产生一种抗原相互连接的网络结构。交联剂比有机溶剂更易于保持细胞的结构，但因为交联阻碍抗体结合，可能会降低一些细胞组分的抗原性，因此需要增加一个通透步骤以使抗体能够进入标本。两种固定方法都可能使蛋白抗原变性，因此使用变性蛋白作为抗原生产的抗体在免疫荧光中可能更为有效。
  - 细胞结构抗原、病毒及一些酶类抗原使用丙酮、乙醇及高浓度的甲醛固定可获得较好的结果，而细胞膜相关组分抗原一般以多聚甲醛固定。细胞器和细胞颗粒内的抗原一般也用多聚甲醛固定，并需要进行通透以使抗体能达到抗原表位。
  - 丙酮本身具有通透作用，因此用丙酮作为固定剂时是不需要通透的。甲醇同样具有通透作用，但有些场合并不适合用甲醇，因为一些表位对甲醇非常敏感。
  - 常用的通透剂是去垢剂，如Triton ，NP-40，以及Tween 20, Saponin, Digitonin 和 Leucoperm等。Triton和NP-40属于烈性去垢剂，可部分溶解细胞核膜，因此非常适合核抗原检测。但应该注意的是，如果在高浓度下使用或者作用时间过长，它们将破坏蛋白，从而影响实验结果。
  - 后面一组去垢剂要温和得多，它们可以在细胞质膜上形成足够大的孔隙以允许抗体通过，但是不会溶解细胞质膜。适于胞质抗原或者质膜上靠近胞质一面的抗原，也适于可溶性的核抗原。
  - Triton X-100是最常用的通透剂，但是它将破坏细胞膜，因此不适用于细胞膜相关抗原。
  - 一般的操作程序是先固定后通透，但针对有些水不溶性的目的抗原的检测宜先通透再固定，这样做的原因主要是可以通过通透去除许多水溶性的蛋白，从而大大减少了免疫荧光的背景和非特异性信号。
  - 封闭的目的是为了减少抗体的非特异性结合，最常用的封闭剂为1% BSA, PBS pH 7.5，其他可选择的封闭剂还有 1% gelatin, 1%bovine 或与二抗种属相同的血清（3-10%）等。
  - 光抗体，因此在这些抗体孵育的时候必须注意避光
  - 抗体孵育应尽量在湿盒中进行
  - 常规的方法是采用甘油或中性树脂封片，为了增强封片的效果，往往需要在封片时添加特殊的抗荧光淬灭剂。
  - 荧光色素和蛋白质分子的稳定性都是相对的，因此随着保存时间的延长，在各种条件影响下，标记蛋白可能变性解离，失去其应有的亮度和特异性。因此给标本的保存带来一定的困难，所以在标本进行荧光染色之后应立即观察。由
  - 性能良好的抗荧光淬灭剂的出现，荧光标记的标本可以在低温（4℃或-20℃）下保存相当长的时间。在某些情形下，考虑到实验的成本及实验条件，也可以采取权宜的办法，比如固定标本片后低温保存，在需要时再进行荧光标记，即随用随染